국가병원체자원은행

[논문]SARS-CoV-2 유행 초기의 진화계통 및 변이분석

Introduction    
The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), has rapidly spread worldwide after being first detected in December 2019 in Wuhan, Hubei, China, and has become a major public health concern globally (Lu et al., 2020; Bogoch et al., 2020). Previous studies have confirmed that this virus can spread from person to person, after identifying clusters of cases among families, including transmission from patients to healthcare workers (Chan et al., 2020). 
COVID-19 mainly causes respiratory illnesses, including cough, sputum production, dyspnoea, and haemoptysis, along with other symptoms such as fatigue, headache, diarrhoea, muscle pain, and lymphopenia (Rothan and Byrareddy, 2020). 
As of August 17, 2020, there have been 21,549,706 cases of SARS-CoV-2 confirmed worldwide, including 767,158 deaths (WHO, 2020).

신종병원체 발굴 보고 논문

신종병원체 발굴 보고 논문 1편과 병원체자원 개발관련 논문 2편을 게재하였다.    

신종병원체 발굴 보고 논문은 “Dermabacter jilbonensis sp. nov., a novel species of the  genus Dermabacter isolated clinical specimen.”이라는 제목으로 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM, 2016, 66:2573-2577)에 게재되었다.     

병원체자원 개발관련 논문은 “Resource Development and Investigation of Novel Species from Unidentified Pathogens in NCCP using MALDI-TOF MS and 16S rRNA Gene Analysis ” 주제로 Journal of Bacteriology and Virology(2016, 46(4), 1~13)에 게재하였고, “Taxonomic Identification of Bacillus Species Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry”라는 제목으로  Ann Clin Microbiol(2016, 19(4), 110-120)에 게재하였다.  

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인플루엔자바이러스 단클론항체 및 하이브리도마 세포주 특허

인플루엔자 A형 또는 B형 바이러스는 모든 국가에서 거의 매년마다 유행성 질병을 일으키며, 주요한 사망 원인 중 하나이다. 
미국의 경우, 유행성 인플루엔자는 약 20%의 사람들에게서 병을 유발시키며, 연간 평 균 20,000명의 사망자 및 114,000명의 입원자가 발생하는 것으로 알려져 있다.  또한 인플루엔자바이러스는 “유전자 재조합”으로 신종바이러스 변이체를 생성하는 유전적 특성을 가지고 있어 매년 발생하는 범유행성의 원인이 되고 있다.  

현재 인플루엔자바이러스에 대한 항체 생산을 위한 항원은 주로 동물세포 또는 베큘로바이러스 시스템 등을 이용한 재조합 항원을 이용하고 있다. 그러나 이 시스템은 생산 단가가 높아 생산 및 공급이 원활하지 않을 뿐만 아니라 높은 가 격으로 연구자들이 쉽게 구입하여 연구에 활용할 수 없는 실정이다. 
이에 국가병원체자원은행은 2011년부터 2013년까지 3년 간 신종인플루엔자범부처사업을 수행하여 인플루엔자바이러스, 항혈청 및 단클론항체를 개발하여 보건의료분야의 연구활성화를 위해 분양하고 있다. 
그 중 분양률이 높았던 단클론항체 및 하이 브리도마세포주를 2015년 10월 13일 특허등록하여 산업체에서 도 활용할 수 있도록 하였다. 

특허등록된 단클론항체 및 하이브 리도마세포주는 기존보다 저렴하고 활용하기 쉽도록 재조합항원 이 아닌 바이러스를 이용한 헤마글루티닌에 대해 개발하였다. 
이는 인플루엔자바이러스 검출 및 이를 위한 키트 제조, 항체의 경 쇄 및 중쇄 상보성 결정구역(CDR)의 염기서열을 이용한 인플루 엔자 치료용 조성물 제조 등에 활용 될 수 있다.  

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병원성대장균 패널개발

식품의약품안전처 고시 “제 213-2204호 : 식품의 기준 및 규격 개정”에 근거하여 장출혈성대장균(EHEC) O157:H7 이외에 다양한 Non O157 베로톡신 생산균주의 분양요청이 증가하면서 다양한 O혈청형 EHEC 패널의 개발이 요구되었다.   그에 따라 국가병원체자원에서 보유중인 전체 Escherichia coli 자 원 중 수인성질환과에서 연도별로 기탁한 병원성대장균 513주 중 분리정보 등 자원의 기본정보를 모두 갖고 있는 147주를 선별하였다.  기탁정보 및 품질 확인을 위해 생화학적 실험, 병원성인자 관련 유전자를 보유 확인,혈청형 및 항체가 실험을 실시하여 EHEC O103 VT1 등 31주의 병원성대장균 패널을 개발하였다.    #IMAGE01#

베로독소 확인시험법 참조주 개발

2011년 독일에서 발생하여 유럽 및 북미로 빠르게 전파된 EHEC O104형에 의한 집단 식중독은 독소유전자가 병원성 대장균에서 비병원성 대장균으로 이동할 수 있음을 보여주었다.  
따라서 2013년 8월 식품의약품안전처에서는 이를 반영하여 기존 대장균 배양법과 함께 PCR 방법을 통하여 베로독소유전자 유무를 확인하는 시험법을 포함한 [식품공전, 제9호]를 개정·발표하였다.  

이에 국가병원체자원은행에서는 국내 분리균주를 이용하여 두 유형의 베로독소 확인 시험법에 활용할 수 있는 참조주를 발굴하고자 하였다. 
국가병원체자원은행에서는 국내 분리균주 중 stx1 과 stx2 type 유전자 모두를 보유한 베로독소 생산 E. coli 로 NCCP15739를 보유하고 있으며, 생화학적 특성분석, 단백체 질량분석 및 유전자 염기서열분석을 종합하여, 종 동정을 수행하였으며 EHEC 및 ETEC를 검출하기 위하여 Multiplex PCR 방법을 활용하여 베로독소유전자의 유무를 확인한 결과, 베로독소 두 유형 모두를 지니고 있음이 최종 확인되었다.  
따라서 국가병원체자원은행은 베로독소 확인 시험법에 사용되는 대조군으로 NCCP15739를 선정하였고, 현재, 한국기능식품연구원을 포함한 6개 기관에서 베로독소 확인시험 대조군으로 본 균주를 분양 수령하였으며, 이후에도 본 균주에 대하여 분양요청 수요가 많을 것으로 기대된다.  

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Vibrio 속 병원체에 대한 최적 장기보존법 개발

현재 국가보유 병원체자원의 관리는 동결건조방법을 이용한 장기보존을 원칙으로 하고 있다.  
이 방법은 세계적인 culture collection들에서 통용되고 있을 뿐만 아니라 현재까지 알려진 장기보존법 중 가장 효율이 우수한 방법 중 하나이다. 그러나 skim milk를 동결건조보호제로 사용하는 현재의 획일화된 보존법으로는 일부 약한 생존력을 가진 균주에 대한 자원소실우려가 있어 보유자원의 안정적 관리를 위한 자원맞춤형 보존법 개발이 요구되고 있는 실정이다. 

따라서 유용병원체자원개발 연구단은 장기보존이 어려운 것으로 알려져 있는 비브리오속 병원체를 대상으로 「병원체 맞춤형 최적 장기보존법 개발」 연구를 수행하였다. 
연구결과 비브리오속 병원체의 장기보존을 위해서는 5% inositol을 보존제로 사용하여 -80℃에서 18시간 동결과정을 거친 후 -80℃, 1 p a 의 기 압 하 에 서 1 8 시 간 동 안 동 결 건 조 를 수 행 하 는 것 이 생존율 향상을 위한 비브리오속 병원체의 최적 장기보존 절차이며 장기보존 후 재생률을 높이기 위해서는 3% NaCl을 첨가한 LB broth를 사용하는 것이 효과적임을 증명하였다.  

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병원체자원 동정 및 분석기술 고도화 연구

국가병원체자원은행에서는 병원체자원 동정 및 특성 확인 방법으로 Matrix-Assisted Laser Desorption /Ionization Time of Flight(MALDI-TOF) 질량분석기 (Bruker Daltonics, Inc., Bremen, Germany)를 사용하고 있다. 
등록되어있는 병원체자원 중 Bacillus, Escherichia 속 6종 100주를 대상으로 MALDI-TOF를 이용하여 각각의 단백체 프로파일을 확보하였다. 
5종의 Bacillus, E. coli 균종의 대표적인 단백체 프로파일은 다음과 같다(Figure 1). 

향후 유전자기반 DNA 핑거프린팅방법과의 비교분석을 수행하고 병원체자원 동정과 특성 확인에 활용할 수 있는 신규분자지표 탐색을 진행할 예정이다. 
국내임상분리 병원체자원에 대해 지속적으로 단백체 프로파일을 확보함으로써 병원체자원 동정 및 분석기술 향상에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대한다.

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국가인증시험용 참조균주의 국산화를 위한 대체 병원체자원 개발

국가인증시험에 사용되는 참조균주의 대부분은 국외은행에서 유래한 균주를 사용하고 있어 외화유출과 수입시 복잡한 절차를 부담해야 하기에 국내 분리자원을 이용한 대체균주를 개발하고자 하였다. 
식약처에서 규정하고 있는 식품첨가물공전내 살균소독력 시험법에 적용되어 있는 참조균주 중 Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serovar Typhimurium의 3종에 대하여 대체균주 개발을 시도하였다. 

국가병원체자원은행에서 수집한 국내분리 병원체자원들을 대상으로 특성분석 및 16s rRNA 염기서열분석을 하여 그 결과를 참조균주의 것과 대조하였다. 염기서열이 100% 일치하거나 가장 높은 유사도를 나타내는 균주를 선별하였다. 
선별된 후보균주들을 대상으로 시험법인 살균소독력 시험법을 적용하여 유효성 평가를 실시하여 참조균주와 가장 유사한 후보균주를 최종 선정하였다.   

이중 E. coli 와 L. monocytogenes의 경우 NGS (Next Generation Sequencing)을 실시하여 전체 염기서열의 유사도를 측정하였다. 그 결과 E. coli는 NCCP10536가 99.4% 염기서열 일치도를 보였고, L. monocytogenes의 경우 NCCP 14397과 93.4% 일치도를 보였다. 
E. coli ATCC 10536의 대체균주로 NCCP 13896, NCCP 14134가 선정되었으며, L. monocytogenes ATCC 19115의 대체균주로 NCCP 14397이 선정되었고, S. enterica serovar Typhimurium ATCC13311의 대체균주로 KBN06P01091, KBN06P02659, KBN06P03372가 선정되었다.  

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신종 원인병원체 탐색 및 발굴(2017년)

국내 임상분리 미동정 병원체자원의 수집을 통해 환자의 흉수에서 Gemella jeonjuensis가 분리되었다.
G. jeonjuensis는 그람 양성, 조건무산소성, 옥시다아제 음성, 카탈라아제 음성, 운동성이 없는 구균의 특성을 가지고 있다. 
G. jeonjuensis는 16s rRNA 염기서열 분석법(Gemella bergeri와 유사도 98.11%)과 MALDI-TOF MS 단백체패턴분석법(Gemella bergeri와 비교 수치 1.891)을 통해 신종병원체 후보로 선정되었다. 
G. jeonjuensis의 계통 분석 결과 심내막염의 병원균으로 알려진 Gemella 속의 Gemella bergeri ATCC 700627T과의 98.11%의 유사도를 나타내었다. G. jeonjuensis는 37℃, pH 7에서 최적의 생장을 나타내었다.   
G. jeonjuensis의 세포 지방산 분석 결과는 C16:0(47.47%), C10:0(7.66%), C14:0(7.01%)이었고, DNA G+C함량은 31.02 mol%, Gemella bergeri ATCC 700627T와의 DNA-DNA 유사도는 25.02%±3.332의 결과를 나타내었다. 
표현형과 유전형의 특성을 근거로 G. jeonjuensis는 Gemella 속의 신종으로 확인 되었다. G. jeonjuensis는 표준균주 번호 6198T로 정하였고, NCCP와 DSMZ에 기탁을 하여 NCCP 16335T, DSM 106135T의 각 기관의 균주 번호를 부여받았다.  

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신종병원체 발굴(2016년)

국가병원체자원은행은 유용병원체자원개발연구단의 내부연구를 통하여 신종병원체자원 1종을 발굴하였다. 
그 결과 2016년 신종병원체 보고를 위한 국제공인 논문인 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)에 “Dermabacter jinjuensis sp. nov., a novel species of the genus Dermabacter isolated from a clinical specimen”이라는 제목으로 게재 확정되었다. 
이 신종병원체는 수지괴사환자의 임상 검체에서 최초 분리되었으며 그람양성, 카탈라제 양성의 통성혐기성 세균으로 확인 되었다. 세균을 동정하는 방법인 16S rRNA 염기서열 분석 결과 Dermabacter 속의 Dermabacter hominis와 16S rRNA 염기서열 유사도 98.34%를 보였고, MALDI-TOF MS 결과 Dermabacter hominis와 1.886의 유사도를 나타내어 신종병원체 후보주로 선정하여 실험을 진행하였다.    

대조균주인 Dermabacter hominis와 세균의 형태학 • 생화학 • 분자생물학적 특성분석 실험들을 진행하였고, DNA-DNA hybridization을 진행하여 49±1.6%의 결과를 얻어 신종병원체임을 확인하였다. Dermabacter 속의 병원체가 분리된 지역인 경상남도 진주시의 명칭을 토대로 Dermabacter jinjuensis라 명명하였다.  

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